【自有技术大讲堂】显微光学成像原理与技术

一、 引言

显微镜是20世纪人类最伟大的发明之一，最早的显微镜是由两块凸透镜组成，用于观察微小生物。随着科学技术不断发展，人们对显微镜的需求越来越大，尤其是在生物、医疗、生产制造业等领域。根据不同的应用领域，可以分为光学显微镜与电子显微镜。光学显微镜主要由目镜、物镜、载物台和反光镜组成，主要有如下几种类型的显微镜：生物显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、体视显微镜和共聚焦显微镜等。电子显微镜利用电子束成像，相较于光学显微镜，具有更高的成像分辨率和放大倍率。

二、 显微光学成像原理

显微成像系统由物镜和目镜组成，物体AB处于物镜1倍至2倍焦距处，物镜对物体AB成倒立的放大的实像A1B1，实像A1B1处于目镜1倍焦距内，目镜对实像A1B1成正立的放大的虚像A2B2，相对于物体AB，成一个倒立的放大的虚像。不同的物镜和目镜的焦距大小以及相对距离可以改变显微成像系统的放大倍率，实现各种尺寸特征的显微成像。

显微镜参数： 数值孔径NA：光学系统的一个无量纲的数值，用于衡量该系统能够收集光的角度范围，决定了系统的空间分辨率，NA=n*sinα，α为孔径角。 分辨率σ：光学系统能分辨两个临近点的极限距离，σ=0.61λ/NA，λ为波长。 放大倍率τ：τ= ，为光学筒长，、分别为物镜和目镜的焦距。

三、 显微镜类型

普通光学显微镜：主要用于生物研究与物理学实验室，可以选配固定放大倍率的显微物镜或者连续变倍的显微物镜，常见的放大倍率为1倍到100倍。

偏光显微镜：用于研究透明与不透明各向异性材料的一种显微镜，利用偏振光鉴别物质的单折射率或者双折射性，在地质学等理工科专业中有重要应用。

微分干涉相衬显微镜：用于观察具有立体结构的微小物体，利用偏振片和Wollaston棱镜将光束分为寻常光与非寻常光，两束光受物体高度信息调制而产生光程差，最终呈现出具有立体感的图像，相对于普通光学显微镜，能更快速的观察物体的三维信息，下图的小凸点清晰可见。

激光共聚焦显微镜：用于更高分辨率成像，利用一对共轭针孔进行“空间滤波”，将焦平面以外的杂散光滤除以提高纵向分辨率，实现非侵入式的“光学切片”。当所观察的对象较厚时，传统的荧光显微镜无法接收焦平面以外的信息。激光共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。 其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析物体的三维空间结构。

超分辨显微镜：传统的显微镜分辨率受制于光学衍射极限，一般的可见光照明显微镜分辨率的极限为200纳米。利用结构光照明显微术（Structured Illumination Microscopy, SIM）、受激辐射耗尽显微术（Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED）和单分子定位和构图技术（Single Molecule Localization and Composition）可以突破衍射极限，使得光学分辨率达到20-30纳米。

四、 总结

显微镜在日常生活、生产制造、医疗科学等领域的应用需求越来越多。随着检测对象偏向微米纳米级，在保证足够的放大倍率的同时，仍需具有高的分辨率。电子显微镜采用电子束成像的方法，分辨率可高达0.2纳米；超分辨显微成像的分辨率可达20-30纳米；普通显微镜的分辨率可达200纳米，然而高分辨率的显微镜往往伴随着小视场与高成本等劣势，因此可以针对不同的应用需求选择合适的显微镜。